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游離核酸抽提方法選擇指引 遠慕新聞√

提供者:上海遠慕生物科技有限公司   發布時間:2019/8/22  閱讀次數:149次   進入該公司展臺

人體細胞在凋亡的過程中,DNA斷裂并分泌至細胞外。健康細胞,胎兒細胞,腫瘤細胞以及移植的細胞都可以通過這種方式釋放游離DNA至血液中。同時cfDNA(cell-free DNA) 是腫瘤和產前診斷研究中,被證實有用的標記物。

隨著液體活檢技術的不斷發展,對這些的游離核酸檢測有望成為替代組織活檢的重要方法。大家比較熟悉的游離核酸檢測手段有定量PCR、NGS等傳統方法和正在迅猛發展的數字PCR。

但cfDNA在體液中的含量非常低,通常血清中含量低于10ng/mL。 如何從含量如此低的樣本中,抽提出適合檢測手段的游離核酸?

液體活檢技術的興起,使得游離核酸樣本的數量大增,高通量形式的核酸抽提成為了工作者們的追求,如何低成本解決通量問題?

那就從下方的描述中找到適合您的游離核酸抽提方式吧。

市面上的游離核酸抽提試劑盒大多是基于柱膜法的原理、還有一部分是基于磁珠法的抽提原理。有單管離心、多管真空抽濾、96孔板真空抽濾、磁珠法高通量等形式。最常用的為多管真空抽濾的方式。

多管真空抽濾

采用真空抽濾的方法,在真空抽濾裝置上,可同時提取24個1-10mL血清、血漿、尿液等樣本, 結合&洗滌過程無需使用離心機。大多客戶用此方法來抽提2-4mL血漿,得到的游離核酸用于后續的PCR、NGS、甲基化研究。整個抽提過程需要約45min-3h不等,具體的操作時間要根據使用的品牌來定。

NucleoSnap® DNA Plasma 僅需要45min 即可完成EDTA處理的血漿游離核酸的抽提,是目前提取速度較快的游離核酸提取試劑盒。提取到的游離核酸可用于NGS, qPCR, ddPCR等檢測手段。

應用數據:

從5mL EDTA血漿中純化cfDNA
NucleoSnap® DNA Plasma kit 和競爭對手(Competitor Q)比較結果

從Cell-Free DNA BCT® (Streck)提取cfDNA
 3個不同Cell-free DNA BCT® 保存的樣品,分別使用 NucleoSnap® DNA Plasma (MN) 和a vacuum-processed kit of a competitor (Q)提取cfDNA.使用Bioanalyzer™ 2100 with a High Sensitivity DNA Kit (Agilent)檢測,分離到的游離核酸在170bp附近有典型的峰(箭頭標記)

10mL尿液中分離cfDNA電泳圖
抽提的cfDNA使用 Bioanalyzer™ 2100 with a High Sensitivity DNA Kit (Agilent)分析,在170bp附近有典型的片段分布

單管離心

單管離心抽提游離核酸的方法一般適用于小體積血清或者血漿樣本,通常樣本體積范圍在200uL-2mL。由于樣本上樣量少,游離核酸的得率也較多管真空抽濾的方式要低。此類方法得到的游離核酸一般用來進行PCR、qPCR等分子檢測。

PCR需要的模板量一般是很低的。常規的20-30uL洗脫體積,一般只用到10%。有沒有一種方法可以讓洗脫體積更小,單位體積里面濃縮更豐富的核酸?

NucleoSpin® Plasma XS應運而生,采用獨特的設計,柱膜直徑是普通柱膜的一半,僅需要240uL 血漿,5-20uL洗脫液,就可以得到的高濃度核酸,后續的QPCR檢測靈敏度也更高。

洗脫體積的大小決定于柱膜直徑!

MN NucleoSpin® Plasma XS:柱膜面積最小,僅5–20 μL洗脫體積就可以得到有效的游離核酸.
Competitor Q (Q):盡管此試劑盒適用于小樣本量,但是沒有針對此應用做專門的設計,洗脫體積至少 20–30 μL.

 
NucleoSpin® Plasma XS非常適合孕婦血漿中游離核酸檢測。

應用數據:

PCR檢測cfDNA中的RHD和Amelogenin基因NucleoSpin®Plasma XS和MagNA Pure Compact Nucleic Isolation Kit I – Large Volume相比,相同的上樣量 NucleoSpin®表現出更好的性能,分別提前2.6 cycles (RHD gene) 和 2.1 cycles (Amelogenin) 捕獲到PCR信號。
Data kindly provided by Dr. Doescher, DRK Blutspendedienst NSTOB, Oldenburg, Germany

PCR檢測cfDNA中k-ras基因NucleoSpin® Plasma XS 和QIAamp DNA Blood Midi相比,NucleoSpin® Plasma XS在低于2.7倍PCR上樣量的同時,提前2.1cycles捕獲到PCR信息。
Data kindly provided by Dolores C. García-Olmo, PhD, Unidad de Investigación, Complejo Hospitalario Universitario de Albacete, Albacete, Spain

談論到單管離心的方式提取游離核酸,還要給大家介紹一款產品Covaris truXTRAC™ cfDNA。

Covaris truXTRAC® cfDNA提取試劑盒配合Covaris自動聚焦超聲技術(Adaptive Focused Acoustics,AFA) ,主動解交聯提取cfDNA,相比傳統方法,cfDNA提取的得率、質量和復雜度都得到顯著提高,更少的血液量即可滿足下游檢測分析需求。同時除提取單核小體凋亡cfDNA外,還可獲取血液中少量存在的核小體二聚體、三聚體cfDNA和非凋亡長片段cfDNA,幫助后續研究獲取更多疾病相關信息!

truXTRAC® 獲取的cfDNA種類更豐富:

不同cfDNA提取方法獲得cfDNA片段分析
用truXTRAC cfDNA和傳統柱提取法Q試劑盒從相同臨床血液樣本中提取的cfDNA通過Fragment Analyzer(AATI)分析。結果顯示truXTRAC cfDNA試劑盒配合AFA技術,無基因組DNA污染,除提取到單核小體凋亡cfDNA外,還獲得了血液中少量存在的核小體二聚體、三聚體cfDNA片段和非凋亡長片段cfDNA,幫助后續研究獲得更多信息,如檢測癌癥患者是否存在耐藥性突變等。

truXTRAC® 顯著提高cfDNA得率:

不同cfDNA提取方法得率比較
用truXTRAC cfDNA和傳統柱提取法Q試劑盒從相同10個臨床血液樣本提取cfDNA。cfDNA得率使用Qbit檢測,柱狀圖表示得率范圍,X表示10個供體cfDNA得率的平均值。結果顯示Covaris truXTRAC cfDNA試劑盒配合AFA技術,顯著提高cfDNA得率。

96孔板真空抽濾

采用柱膜法原理抽提游離核酸,一次可以抽提96個樣本,極大的方便了樣本量較多的客戶。

此類產品一般只適用2mL血漿、血清等樣品,提取到的游離核酸可用于NGS, qPCR, ddPCR等檢測手段。
此類提取方法的代表試劑盒就是NucleoSpin® 96 DNA Plasma。此試劑盒可以在真空抽濾自動化核酸抽提平臺使用,比如:Eppendorf。


NucleoVac 96 Vacuum Manifold

也可以在真空抽濾裝置NucleoVac 96 Vacuum Manifold上使用,此類方法可以極大地節省購買儀器的費用。

應用數據:

采用96孔板抽濾的方式,從2mL血漿中抽提cfDNA的得率結果
無論是不同個體還是不同的采血管均能得到較好的游離核酸抽提結果

磁珠法高通量

磁珠法是最容易實現自動化通量抽提的一種核酸抽提方式,可處理1-10mL血漿樣品,形式也更靈活。提取到的游離核酸可用于NGS, qPCR, ddPCR等檢測手段。

磁珠法得率的高低主要取決于試劑盒中磁珠的類型。NucleoMag® DNA Plasma采用MN 磁珠- 超順磁性。“超順磁性”代表磁珠可以被磁場吸附,但是自身不會被磁化,不會聚集在一起,很容易在溶液中被懸浮;磁珠直徑 1–3 µm,能夠保證沉降時間,更有利于HTP處理方式,此外小珠有更大的聚集表面積,這也是磁珠擁有最大結合能力所必須的。

從不同體積的血漿中分離cfDNA
通過Bioanalyzer™ 2100 系統和PicoGreen™ quantification assay檢測5組血漿中提取的游離核酸結果顯示,The NucleoMag® DNA Plasma kit 可以從2-10mL血漿中高效的提取。

關鍵詞:遠慕生物  生物試劑  細胞  

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